质粒是携带遗传信息的闭合环状的DNA分子。重组的质粒DNA，广泛应用于细胞和基因治疗病毒载体生产、基因诊断、mRNA基因疫苗生产等领域。质粒既可以是原料，原液，也可以是药物本身，如DNA疫苗。

做质粒生产最担心什么？某基因治疗制药企业在申报美国IND时，被问到的第一个问题就是如何控制质粒的交叉污染问题。为什么美国FDA会如此关注质粒的交叉污染问题？试想目标质粒在生产过程中如果混杂了其它携带不同DNA序列的质粒，在进行病毒包装或在mRNA转录过程中，杂质的序列被包装在病毒载体中或者做为模板被转录为mRNA，翻译成目标产品以外的产品，会出现什么问题？

细胞和基因治疗领域热度持续，全球范围内研发管线数量空前，对高质量临床级别的质粒和质粒商业化的需求也随之大幅增多。因此创新药企业及CDMO共同面临共线生产多个质粒的课题。在多个质粒的生产过程中，如果采用共用设备和耗材，交叉污染的风险就大幅提高。

国内外各药品监管机构和组织对药品共线生产的交叉污染风险也给予了高度关注，要求在GMP 检查过程中关注药品生产企业是否采取了针对交叉污染的风险管理措施。

我们先看看目前行业中最普遍的质粒生产步骤：上游的发酵，下游的碱裂解，超滤及三步层析，浓缩换液的生产工艺。

在这个传统质粒生产工艺中，不同批次间共用发酵罐、碱裂解系统、超滤、层析设备，一个批次生产结束需要对所有设备进行清洁，并通过清洁验证证实清洁方法的可靠性，从而控制交叉污染的风险。

然而质粒DNA本身性质特殊，给清洗带来极高难度。质粒DNA带电荷，并具有多态性。在生产过程中不同形态的超螺旋质粒，开环，线性片段，聚体等并存，因此粘度非常高，粘附在设备，耗材，填料表面非常难以被清洗干净。目前在其它生物制品生产过程中一般采用的比较有效的CIP方法或有机溶剂清洗方法都难以有效清除质粒。

同时，不锈钢发酵罐和碱裂解系统接触质粒后，会有大量质粒吸附到不锈钢表面及管路、接口等难以清洗的部分，即使采用物理清洗加化学清洗或者其它方法，都很难完全达到质粒的残留的彻底去除。

另外，对于DNA残留的检测方法来说，传统的TOC不能满足专属性的需求，也存在灵敏度的局限，每引入一个产品，就需要开发更灵敏的产品专属的PCR检测，成本非常高。

综上，繁琐的清洗工序不仅增加了生产时间和成本，降低了工作效率，还因为设备耗材和质粒本身的复杂特性难以清洗干净，不同品种间和同一品种批间交叉污染不能完全避免。如果生产出的质粒没有达到放行质量标准，导致产品无法放行不但造成经济损失，还会影响后续生产进度进而影响管线研发进程，而且给临床应用也带来极大的风险。因此质粒共线生产中的交叉污染问题也成为技术专家们最为头疼的挑战。

基于多年来对质粒DNA产品的深厚理解，行诚生物进行了非常深入并且细致扎实的工艺开发和优化并成功地做到了采用一次性发酵罐，和无层析的质粒生产工艺：

既然质粒生产交叉污染源来自上游发酵罐和下游碱裂解和层析的反复使用，那么去除潜在交叉污染源就在于用一次性来取代不锈钢（或其它材质）。行诚生物生产车间及设施设计符合FDA/EMA/NMPA监管要求，从上游发酵到碱裂解再到过滤全流程采用一次性系统和耗材，把批次间交叉污染可能性降到最低。

解决了质粒交叉污染的问题，那么免层析工艺生产出来的质粒质量如何呢？

在菌株筛选，质粒克隆阶段，行诚生物筛选得到优质菌株保证基因完整性，并挑选超螺旋含量高，传代稳定性好的克隆制备菌种库，优化培养基和发酵条件来提高上游质粒的产量和质量，在下游裂解工艺优化中提高得率并有效地控制过程中产生的杂质，因此无需层析即可达到与传统的3步层析工艺可比甚至更优的质量，将与产品相关杂质和HCP、HCD、内毒素等杂质含量控制都保持在行业领先水平。我们案例指标检测结果如下：

综上，行诚生物采用全一次性设备耗材的无层析生产工艺，彻底避免了质粒的交叉污染。数据也证明了即使采用qPCR的方法，批次间交叉污染都低于检测方法的检出限。

同时由于免去繁琐的清洗验证步骤和层析步骤，大幅降低成本和碳排放。同时大大提高了生产效率，从发酵开始到完成分装仅耗时4天，为客户节省至少50%项目时间。

免层析的质粒生产工艺结合全流程的一次性解决方案，从源头上避免了交叉污染风险，提高质量，赋能药品的安全性。同时工艺步骤减少和效率的提升把经济和时间成本降到最低，增加了药品可及性。做老百姓用的起的基因治疗药物，行诚生物一直在践行！